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질문




 

1. Western blotting 원리

Western blot은 세포나 조직에서 얻은 단백질들에서 특정 단백질 (specific protein)을 검출할 수 있는 실험 방법이다. 기본 원리는 단백질을 size별로 분류한 뒤에 발현 양을 확인하고 싶은 항체를 이용하여 확인 하는 것이다. 즉, 항원-항체 반응을 이용한 단백질의 발현을 확인할 수 있는 실험 방법이다. 그렇다면 각 workflow 별로 좀 더 자세히 알아보도록 하겠다.

전기영동에 영향을 주는 요인들은 세 가지가 있다.

  1. 단백질의 크기 즉, size이다. 단백질의 크기가 클수록 polyacrylamide gel을 통과하는 속도가 늦어지게 되고 위쪽에 남게 된다.
  2. 단백질이 갖는 전하 (charge)가 영향을 준다. 전기 영동은 말 그대로 전기로 물질을 움직이게 하는 것이기 때문에 단백질 자체가 전하를 띄게 되면 전기 영동되는 속도가 달라진다.
  3. 단백질의 구조 또한 전기 영동에 영향을 준다. 사이즈는 같으나 작게 뭉쳐져 있는 단백질 A와 크게 퍼져 있는 단백질 B가 있다. 당연히 작게 뭉쳐져 있는 단백질A가 크게 퍼져있는 단백질 B보다 훨씬 잘 움직일 수 있다.

Western blot의 목적은 size별로 단백질을 분류하고 western blotting 원리인 항원 항체 반응을 이용하여 target 단백질을 검출하는 것이 목적이다. 다시 말하면, 단백질의 전하와 구조라는 변수는 제거 해야 한다는 것이다. 그 방법에 대해서 알아보자.

1) 단백질의 전하 – Western blot에서 SDS의 역할

Western blotting 원리는 항원 항체 반응이지만 아무렇게나 항체를 반응 시키는 것이 아니다. Western blotting 수행하기 위해서 sample을 준비하는 과정을 거쳐야 한다. 이 step에서 굉장히 중요한 역할을 하는 것이 sodium dodecyl sulfate (SDS) 이다. SDS는 detergent로 세포막을 녹여 단백질이 밖으로 나올수 있게 할 뿐만 아니라 단백질을 coating하여 negative charge로 바꾸어 준다. 위에서 말했듯이 전하는 전기영동의 속도에 영향을 줄 수 있다. 하지만, SDS가 모두 음전하로 바꾸어 주었기 때문에 전하라는 변수를 없에고 오직 size로만 분류가 가능하게 하는 것이다.

2) 단백질의 구조 – Western blot β-mercaptoethanol의 역할

이외에도 고려해야 할 것이 바로 단백질의 구조이다. 단백질은 2차 구조, 3차 구조를 형성하고 있어서 사이즈가 같다고 하더라고 어떠한 형태를 띄고 있는가에 따라서 전기 영동에서 다르게 분류될 수 있다. 위에서도 말했듯이 단백질의 size는 같으나 작게 뭉쳐져 있는 단백질과 넓게 퍼져있는 단백질은 전기 영동 할 때 전기에 의해 움직이는 속도가 달라지게 된다. 그래서 모두 같은 구조로 만들어주기 위해서 linear 형태로 만들어주게 된다. linear 구조로 만드는 것이 β-mercaptoethanol이다. β-mercaptoethanol은 이황화 결합 (disulfide bond)를 끊어 주어 단백질이 형성하고 있는 구조를 linear 형태로 바꾸는 역할을 한다.

2. Sodium dodecyl sulfate – Polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)

Sampling 과정을 거쳐서 준비된 단백질 시료를 SDS-PAGE gel에 loading 하고 전기를 걸어주어 size별로 분류하는 과정이다. polyacrylamide gel이 단백질을 size별로 분류하기 좋은 이유는 다음과 같다.

  1. 전기적으로 중성이다.
  2. 친수성이다.
  3. SDS-PAGE에 사용되는 buffer와 반응하지 않는다.
  4. 단백질과 결합력이 매우 낮다.

정리하자면 단백질을 size만을 고려하여 분류할 수 있는 gel이라고 생각하면 된다.

3. Polyacrylamide gel (PAGE)

Polyacrylamide gel은 bis-acrylamdie에 ammonium persulfate (APS)와 tetramethylethylenediamine (TEMED)를 넣어주면 polymerization 시작되며, 이 속도는 온도와 농도에 따라 다르다. Western blot에서는 주로 8~15%의 gel이 사용되는데 % 농도가 높을수록 작은 size의 단백질을 분류하는데 유리하며 반대로 % 농도가 낮을 수록 큰 단백질을 분리하는데 용이하다. .

Stacking gel 원리 & Separating gel 원리

Stacking gel은 loading 된 sample들을 한 줄로 정렬하게 만드는 gel이다. 즉, 출발선을 맞추어 준다고 생각하면 된다. 보통 4%의 낮은 농도로 만들게 되며 pH가 6.8로 sperating gel (pH8.8) 에 비해 낮다. 이 pH가 단백질을 정렬하게 만드는 결정적인 요인이다. pH가 6.8에서는 각 물질들의 이동 속도가 다음과 같다.

Cl– > protein > Glycine (PI=6.2)

즉, 단백질의 이동 속도가 염소 이온과 glycine 사이에 위치하게 되므로 단백질들이 일직선으로 정렬되게 된다. 하지만, 이 물질들이 pH가 8.8인 saperating gel에 도달하게 되면 이동 속도가 다음과 같이 변화된다.

Cl– > Glycine(PI=6.2) > Protein

그러므로, sperating gel에서는 단백질의 size별로 분류가 가능하게 된다.


 



 

4. Transfer (Membrane) 원리

이렇게 분류가 된 단백질들은 blotting membrane으로 transfer 시켜준다.  Polyvinylidene difluoride (PVDF) 와 nitrocellulose (NC) membrane이 주로 사용된다. 각 membrane 별 특성은 아래의 표와 같다.

Binding capacity Sensitivity Background noise
PVDF membrane 170 ~ 200 μg/cm2 High High
NC membrane 80 ~ 100 μg/cm2 Low Low

PVDF membrane에 단백질들이 더 잘 달라붙을 수 있으므로 적은 양의 단백질을 검출하기에는 PVDF membrane이 더 좋다. 하지만 그만큼 민감도가 높기 때문에 background가 지저분하다. NC membrane은 반대라고 생각하면 된다. 단백질들이 달라붙는 능력은 좀 떨어지더라도 background가 깨끗하다는 장점이 있다.

Membrane의 pore size도 고려 해야 하는데 보통 0.1, 0.2 or 0.45μm이 쓰인다. 0.45μm를 일반적을 사용하며 15KD까지는 사용해도 무방하다. 하지만 그 보다 작은 사이즈의 단백질을 detection하고자 한다면 pore size를 더 작은 것을 사용 하는 것이 좋다.

5. Western blot blocking 원리

Blocking은 non-specific binding 즉, 비 특이적인 결합을 줄이기 위해서 수행하는 step이다. Blocking에는 주로 BSA나 Skim milk가 주로 사용되며 이는 membrane의 빈 공간 등을 blocking 함으로써 비 특이적인 반응을 줄여 원하는 target에 항체가 더 잘 붙게 하는 효과가 있다.

6. Detection 원리

단백질을 이 membrane들로 transfer해 준 뒤에 검출하고자 하는 단백질의 primary antibody를 붙여준다. 그 후에 비 특이적인 반응을 제거하기 위해서 wahsing을 해준 뒤 secondary antibody를 붙여준다. Secondary antibody에는 Horseradish Peroxidas (HRP)가 붙어있기 때문에 substrate로 넣어주었을 때 빛을 발산하게 되고 이를 film이나 기계로 detection 할 수 있다.


 



 

Western blot protocol은 크게 Sample preparation, Gel running, Transfer, Blocking, Antibody incubation, Detection이렇게 6가지로 구성되어 있다. 각각 step별로 실험방법과 주의사항을 알아보겠다.

1. Sample Preparation

  1. Culture dish에서 Cell harvest하여 EP tube로 옮긴 후 PBS를 이용하여 washing 하여 cell pellet을 얻는다.
  2. Cell pellet을 RIPA buffer로 lysis 한다. Buffer의 양은 cell의 양과 종류에 따라 다르지만 대략 1 X 106 개의 cell에 약 100µl의 lysis buffer를 넣는다. pipet을 이용하여 잘 섞어준 뒤 가볍게 voltexing하여 Ice에서 15~30min 가량 incubation 시킨다.
  3. 원심 분리하여 cell debris를 가라앉힌다. (14,000 rpm (16,000xg), 15 min, 4°C)
  4. 상층액만 새 튜브로 옮긴다.  
  5. Sample buffer와 잘 섞은 뒤 5min 정도 끓는 물에 중탕 또는 heat block을 이용하여 가열한다. ice 에서 5분 간 식힌 뒤 spin down 하여 액화되어 표면에 맺힌 액체들을 모아준다.

2. SDS-PAGE (gel running)

  1. Sample이 준비되는 동안 gel을 pre-running 해준다 (10 min).
  2. pre-running한 gel 에 sample을 loading 한다. Gel을 직접 만들어 stacking gel이 있는 경우에는 100 V 로 stacking gel 까지 내려준 후 200V로 올려 sperating gel에서 샘플을 running한다 (Gel을 구매하여 사용하는 경우 제조사의 instruction을 따르면 된다.)
  3. 확인하고자 하는 단백질의 크기에 따라서 gel의 %를 결정한다. 절대적인 것은 아니나 다음을 참고하면 된다. (4-5% gel, > 200 kD; 7.5% gel, 120-200 kD; 8-10% gel, 40-120 kD; 13% gel, 15-40 kD; 15% gel, < 20 kD)


3. Transfer

Transfer는 어떤 제조사의 제품을 사용 하느냐에 따라서 카세트의 조립 방법이 다르다. 하지만 공통적인 것은 전류는 (-) 에서 (+) 로 흐르며, sampling이 끝난 단백질은 SDS에 의해 coating되어 음전하를 띄고 있다. 즉 (-)에서 (+) 방향으로 이동하게 되어 있다. 그러므로, (-) 쪽에 Gel이 (+)에 membrane이 있으면 된다. Transfer time 역시 어느 제조사의 transfer tank를 사용 하는지에 따라서 그 시간과 조건이 다르다. 제조사의 instruction을 따르는 것을 추천한다. 다만 transfer에서는 열이 많이 발생하므로 cold room이나 tank를 ice안에 넣고 하는 것을 추천한다. Transfer buffer 역시 미리 차갑게 하여 사용하는 것이 좋다.

많이 사용하는 transfer module maunal


4. Membrane Blocking

3~5%의 BSA나 skim milk를 사용한다. TBST에 녹여 사용하면 된다. Membrane이 잠길 정도면 충분하며 상온에서 1 h 정도 aggitation 하며 blocking한다.


5. Primary Antibody Incubation

Antibody의 dilution은 어떤 antibody를 사용 하느냐에 따라서 다르다. 제조사의 instruction을 따르는 것을 추천한다. 하지만 antibody의 경우 워낙 고가이므로 좀 더 dilution하여 사용하기도 한다. Skim milk를 TBST에 녹인 buffer에 antibody를 dilution하여 사용하는 것이 좋다. 만약 재 사용을 할 계획이 있다면 skim milk는 사용하지 않는 것이 좋으며 sodium azide를 추가하여 사용하는 것이 좋다. 다만 sodium azide를 추가하는 경우 antibody의 활성이 감소하는 경우도 있으므로 주의한다. 4°C 에서 aggitation 하면서 overnight으로 반응시킨다.


6. Washing & Secondary antibody incubation

  1. 10분씩 3~5회정도 TBST로 washing한다.
  2. Washing이 끝난 뒤 secondary antibody를 dilution 하여 상온에서 1 ~ 2 h 정도 반응시킨다.
  3. 반응이 끝난 뒤 TBST로 10 분씩 3~5회 정도 washing 한 후 detection 한다.

Western blot buffer에 대해서 알아보도록 하겠다. 필요한 buffer들의 종류에는 lysis buffer, sample loading buffer, running buffer, transfer buffer, blocking buffer, washing buffer 등이 있다.

1. Lysis buffer

 ionic detergent인 sodium deoxycholate (SDC)가 포함되어 있고 일반적으로 western blot에서 많이 사용되는 buffer이다. 강한 detergent인 SDS와 SDC가 포함되어 있어 핵까지도 모두 lysis할 수 있다. 적은 background를 갖는다는 장점이 있지만 kinase나 protein-protein interaction 등을 방해할 수 있어서 IP나 pull-down assay에서는 잘 사용되지 않는다.

– RIPA buffer 조성 (농도는 working 농도)

  • 50 mM Tris-HCl (pH 8.0)
  • 150 mM NaCl
  • 1% IGEPAL CA-630 or NP-40
  • 0.5% sodium deoxycholate
  • ​0.1% SDS
  • 1X Protease inhibitor cocktail

​2. Loading, running, transfer, and blocking buffers

1) Sample loading buffer

이 buffer의 조성은 딱 정해져 있는 것은 아니다. Sample loading buffer의 조성은 매우 다양하며 lab마다 조금씩 다르다. 하지만 핵심적인 역할을 하는 buffer는 모두 공통적으로 들어있으며 그 농도만 조금씩 다르다. 이 Sample buffer는 sampling 과정에서 가해지는 고온의 열로부터 protein을 보호할 뿐만 아니라 pH의 변화도 최소화 하는 역할을 수행한다. 또한, β-mercaptoethanol의 역할은 이황화결합 (disulfide bond)를 끊어 주어 모든 단백질을 linear form으로 바꾸어준다. SDS 역할 역시 단백질의 linear form에 관여하며 단백질의 charge를 netagive charge로 바꾸어 주는 역할을 수행한다. Glycerol의 역할은 sample의 밀도를 증가시켜 아래로 가라앉게 만드는 역할을 수행하며 이외에도 단백질 안정화에 작용한다.

– Sample buffer 조성

  • 250 mM TrisHCl (pH6.8) – 완충효과
  • 10% SDS – 단백질의 negative charge, linear form 유지
  • 30% Glycerol – sample의 밀도증가, 단백질 안정화
  • 5% β-mercapitalethanol (or 0.5M DTT) – Disulfide bond 제거, linear form에 관여
  • 0.02% bromophenol blue – Sample 위치 확인

2) SDS running buffer (Tris-Glysine)

SDS runnng buffer는 전기영동간에 protein을 linear form으로 유지시켜 size별로 분류시킬 수 있도록 환경을 조성해주는 buffer이다.

– 1X SDS running buffer 조성 (보통 10X로 만들어 보관)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  •  0.1% SDS
  • Check the pH and adjust to 8.3

3) Transfer buffer (wet)

Transfer buffer는 transfer 중에 membrane에 protein이 잘 흡착되도록 환경을 조성해주는 buffer이다. Methanol이나 isopropanol을 넣어주는 이유는 SDS를 제거하여 membrane에 protein이 잘 흡착되게 하기 위함이다.

– 1X transfer buffer 조성 (10X로 만들어 보관, methanol or isopropanol은 사용 직전에 넣어줌)

  • 25 mM Tris base
  • 190 mM glycine
  • Adjust pH 8.3
  • 10% methanol or isopropanol

4) Blocking buffer

Membrane의 빈 공간을 blocking하여 non-specific binding을 줄여주는 buffer이다.

  • 3–5% milk or BSA (bovine serum albumin)
  • Dissolve in TBST buffer

3. Washing buffer

10x TBS buffer 조성 (Tris-buffered saline)

보통 10X로 만들어 보관한다 (1X 사용시 D.W 900ml + 10X TBS 100 ml).

  • 1500 mM NaCl
  • 500 mM Tris-HCl
  • Adjust pH 7.6

1X TBST buffer 조성 (1L 기준)

  • 10X TBS: 100ml
  • Tween-20: 1ml
  • Distilled water: 899ml

4. Stripping buffer

Membrane에 antibody를 붙이고 detection을 한 뒤 다른 antibody를 붙이고 싶을때 사용하는 buffer이다. Membrane에 붙은 antibody들을 제거하는데 사용된다. 사용 후에는 TBST로 충분히 wahsing을 해야 다음 antibody가 붙는데 지장이 없다.

Stripping buffer 조성 (100ml 기준)

  • 10% SDS: 20 mL
  • 0.5 M Tris HCl (pH 6.8): 12.5 mL
  • Distilled water: 67.5 mL
  • ​Add 0.8 mL β-mercaptoethanol under the fume hood


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 


 

(출처https://bio-chae.com/)

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